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二甲基亞砜是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑，在深低溫（零下200度）保存細(xì)胞時(shí)凍存過(guò)程中，為防止細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷，有必要使用含有DMSO冷凍保護(hù)劑。

DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過(guò)程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。深低溫時(shí)二甲基亞砜的細(xì)胞毒性受到抑制，復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快，盡快洗掉二甲基亞砜，否則會(huì)造成對(duì)細(xì)胞嚴(yán)重的毒性。二甲基亞砜（DMSO）是好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，但也是一種以細(xì)胞毒性很大的化學(xué)試驗(yàn)劑，研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中DMSO濃度為10%時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率近100%；1‰濃度時(shí)抑制率為35%，即使是0.04‰的濃度，DMSO對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有不利的影響。

細(xì)胞凍存

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。3、去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)。4、離心1000rpm，5min。5、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的密度為5×106/ml～1×107/ml。6、將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。7、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。8、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。2、從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。3、離心，1000rpm，5min。4、棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。